中药材产业是我国战略性新兴产业，是中医药工业和大健康产业的重要组成部分。随着新药开发及中药产业化对中药活性成分的需求增大，中药材产业将面临资源枯竭、环境破坏和土地短缺等巨大挑战，迫切需要建立中药资源保障新模式。近年来，通过生物技术生产中药活性成分这一方式被广泛应用，而传统放大过程中培养材料生长缓慢，活性成分含量低，难以满足工业化生产要求，因此，筛选优良的培养材料、提升活性成分含量以及研发适合的生物反应器工艺装备，是我国中药资源生物技术生产领域亟待解决的科学难题。我院“人参属药用植物活性成分生物技术生产”课题组专注于研究中药生物技术生产中培养材料含量和装备等问题，以人参属为例，专注于研究和解决其生物技术生产的基础理论及开发应用问题。该课题组团队在Industrial Crops & Products上发表题为“Comparison of polysaccharides in ginseng root cultures and cultivated ginseng and establishment of high-content uronic acid plant synthesis system”文章，其中高文远教授为通讯作者，王娟副教授为共同第一作者，天津大学温州安全（应急）研究院为第一作者单位，对人参组织培养物和传统栽培人参（辽宁5年人参）中多糖成分进行了比较分析。在本次研究中，课题组分析了人参不定根培养物中多糖的组成特征。与栽培人参相比，人参不定根培养物中人参多糖的相对分子量更小，半乳糖醛酸等酸性多糖的比例更高。相应地，与栽培人参相比，人参不定根培养物的多糖具有更高的肠道微生物多样性和乳酸杆菌丰度。在此基础上，课题组通过半乳糖醛酸基因编辑构建了人参不定根培养物的遗传转化系统，以此显著增加了糖醛酸的含量。本次研究为人参多糖药物和保健品的开发奠定了基础。
研究背景
人参的市场需求逐渐扩大，应用前景越来越广阔。目前，野生人参濒临灭绝，田间栽培是主要来源。由于人参生长周期长（4-5年），连作困难，严重阻碍了中国人参产业的可持续发展。植物组织培养技术可以在不受外界环境影响的情况下获得再生植株或进行器官培养，具有节约土地资源、缩短繁殖时间的优点。因此，课题组可以通过培养人参不定根培养物来生产人参的活性成分。关于人参不定根培养物中人参皂苷的一些研究很早就开始了，然而，关于人参不定根培养物中多糖的研究很少。在这项研究中，课题组发现人参不定根培养物中酸性果胶的含量更丰富。所有果胶多糖含有α-1,4-GalA，它是糖链的骨架。因此，为了进一步提高人参不定根培养物中酸性果胶的含量，课题组利用CRISPR/cas9技术编辑了聚半乳糖醛酸1,4-α-半乳糖醛酸转移酶基因。
实验结果
多糖的化学组成
通过傅立叶变换红外光谱对从栽培人参提取的多糖（CGP）和人参不定根培养物提取的多糖（ARGP）进行测定，结果表明，两种多糖的主要官能团相同，ARGP中没有新的结构。
图1. 栽培人参提取的多糖（CGP）和人参不定根培养物提取的多糖（ARGP）傅立叶变换红外光谱对照来源Industrial Crops & Products
多糖的初步纯化及其对人肠道菌群的影响
人参多糖一般分为淀粉类多糖和酸性人参果胶两类，除人参皂苷外，人参果胶也是人参的主要活性成分之一，其主链上普遍富含半乳糖醛酸。研究表明，ARGP中酸性多糖含量高于CGP，ARGP中其他单糖种类也更多。与免疫相关的乳酸菌和丁酸的含量与中性多糖和酸性果胶的比例以及人参果胶中不同结构域的比例密切相关。本次研究表明，ARGP中果胶成分较多，果胶中I型鼠李半乳糖醛酸钠（RG-I）的比例较大，对免疫调节作用更好。
来源 Industrial Crops & Products
图3. 栽培人参提取的多糖（CGP）和人参不定根培养物提取的多糖（ARGP）种类分析来源Industrial Crops & Products
CRISPR/cas9的建设和改造
本次研究以载体pP1C.4为模板，通过PCR获得了sgRNA的克隆框架。将重组产物转化为E.Coli.，对在LB培养基上产生的卡那霉素耐药单菌落进行了PCR验证。将阳性重组质粒转化为农杆菌C58C1感受态细胞。
来源Industrial Crops & Products
高含量糖醛酸遗传转化体系的建立
本研究通过对半乳糖醛酸的基因编辑，显著提高了糖醛酸的含量，构建了人参不定根培养的遗传转化系统。此外，无基因突变组的糖醛酸含量有增加，这可能是由于基因过度表达引起的。
小结
人参多糖作为人参的重要活性成分，目前已得到广泛而深入的研究。然而，作为人参的替代资源，人参不定根培养物中的多糖很少被研究。本研究从栽培人参和人参不定根培养物中提取多糖。从初步分离中确定，酸性多糖的比例占ARGP的比例大于CGP。不同多糖与肠道菌群共发酵。与pARGP共发酵24小时后，乳酸杆菌的比例急剧增加，这可以提高人体的免疫能力。pARGP中RG-I的比例增大可能是其免疫能力提高的主要原因。最后，项目团队对高糖醛酸含量人参遗传转化体系进行构建，有助于发展和壮大人参属保健食品产业。
